隨著生物醫(yī)藥行業(yè)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的多肽藥物被開發(fā)用于治療各種疾病。但是由于多肽口服生物利用度差需要注射給藥，會(huì)降低患者的依從性，尤其對(duì)于需要長(zhǎng)期治療的疾病。口服給藥是較為理想的給藥方式，但多肽藥物在胃腸道穩(wěn)定性差、分子量大、難以透過(guò)腸道上皮等特點(diǎn)均限制了其開發(fā)口服制劑。隨著對(duì)多肽口服吸收機(jī)理的深入了解，科學(xué)家開發(fā)的技術(shù)手段打破了多肽胃腸道吸收的壁壘，一些口服多肽藥物已經(jīng)成功上市。

下表1總結(jié)了已上市吸收入血的口服多肽藥物，數(shù)量仍然比較有限。環(huán)孢菌素為分子量1202.61的環(huán)肽，是第一個(gè)上市的口服多肽藥物。但是環(huán)孢菌素本身的分子量較小，環(huán)肽的結(jié)構(gòu)也增加了穩(wěn)定性。環(huán)孢菌素上市之后多年，口服多肽藥物一直沒(méi)有取得顯著性進(jìn)展。直到2019年口服司美格魯肽上市，采用促滲透劑SNAC增加多肽的胃腸道吸收，為口服多肽的研發(fā)開辟了新的路徑。口服胰島素的開發(fā)可謂歷史悠久，這一構(gòu)想始于1922年^[1]。但直到2023年，口服胰島素腸溶膠囊Oramed才在中國(guó)申報(bào)上市。

表1. 已上市吸收入血的口服多肽藥物

提高多肽口服吸收的策略

多肽藥物想要達(dá)到理想的口服吸收，往往需要多維度的助力。

• 結(jié)構(gòu)優(yōu)化：針對(duì)多肽鏈的結(jié)構(gòu)修飾，防止多肽在胃腸道水解，提高多肽的胃腸道穩(wěn)定性；提高多肽的體內(nèi)代謝穩(wěn)定性，延長(zhǎng)生物半衰期。

• 促滲透劑：通過(guò)促滲透劑改變胃腸道上皮的緊密連接，提高滲透性，也是目前口服多肽的常用策略。常見的促滲透劑包括表面活性劑癸酸鈉、辛酸鈉，螯合劑EDTA、檸檬酸等。

• 制劑手段：比如自乳化制劑，通過(guò)提高難溶性藥物在胃腸道的溶解度，促進(jìn)吸收；腸溶膠囊可避免多肽藥物在胃部釋放，減少胃內(nèi)降解等。

• pH調(diào)節(jié)劑：胃腸道的酶活性與pH值息息相關(guān)，pH調(diào)節(jié)劑可通過(guò)改變胃腸道局部的pH值，影響酶的活性，減少多肽在胃腸道的降解。

研究口服多肽胃腸道吸收的評(píng)估體系

對(duì)于口服多肽的早期篩選評(píng)價(jià)，需要確認(rèn)多肽能否通過(guò)口服吸收，以及影響多肽口服吸收的主要因素，并進(jìn)行有針對(duì)性地優(yōu)化，以提高多肽的口服生物利用度。本文主要關(guān)注胃腸道對(duì)多肽吸收的影響，因此主要介紹胃腸道吸收相關(guān)的體外和體內(nèi)研究體系。

體外胃腸液穩(wěn)定性

胃腸道中含有大量的蛋白水解酶，可使多肽在胃腸道產(chǎn)生降解。所以多肽在胃腸液中的穩(wěn)定性是影響口服吸收的第一道屏障。Wang等人^[2]研究了17種肽類藥物在胃腸道的穩(wěn)定性，結(jié)果表明在人胃液中，分子量較小的肽表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性；在人小腸液中，環(huán)狀的肽具有相對(duì)較好的穩(wěn)定性。根據(jù)模擬胃腸液穩(wěn)定性的結(jié)果，可有針對(duì)性地設(shè)計(jì)多肽在特定部位吸收，或優(yōu)化多肽的結(jié)構(gòu)來(lái)提高胃腸道中的穩(wěn)定性。

體外細(xì)胞模型

Caco-2被認(rèn)為是體外評(píng)估腸道滲透性的金標(biāo)準(zhǔn)。Caroline等人^[3]采用Caco-2細(xì)胞，評(píng)估SNAC和癸酸鈉(C10)的促滲透作用以及促滲透的機(jī)理。結(jié)果顯示（見圖1），C10可降低Caco-2細(xì)胞單層膜的跨膜電阻（TEER），并在8.5 mM和10 mM濃度下顯著增加了熒光探針FITC-4000（熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖）的滲透性。而SNAC除了在40 mM濃度下對(duì)TEER 和FITC-4000的滲透性產(chǎn)生顯著影響，其他濃度下對(duì)這兩個(gè)參數(shù)都沒(méi)有影響。相關(guān)機(jī)理研究顯示，C10可引起Caco-2細(xì)胞中三種緊密連接蛋白（claudin-5, ZO-1和occludin）的重組，而SNAC只影響了claudin-5的定位。因此，根據(jù)研究目的可選擇Caco-2評(píng)價(jià)促滲透劑對(duì)多肽滲透性的影響。也有文獻(xiàn)報(bào)道人工生物膜PAMPA也可用于多肽的體外滲透評(píng)價(jià)^[4]。但如果評(píng)價(jià)促滲透劑的作用，根據(jù)其作用機(jī)理，建議選擇Caco-2細(xì)胞模型而非人工生物膜用于評(píng)價(jià)。

針對(duì)多肽類等低滲透性化合物，藥明康德DMPK部門開發(fā)并驗(yàn)證了過(guò)夜預(yù)孵育方法，通過(guò)將測(cè)試化合物與細(xì)胞預(yù)孵育20小時(shí)以上，再加入測(cè)試化合物進(jìn)行雙向滲透試驗(yàn)，來(lái)評(píng)估化合物的滲透性。此方法在細(xì)胞預(yù)飽和的基礎(chǔ)上，能夠有效測(cè)得化合物的滲透性，也可用來(lái)篩選不同促滲透劑的促滲作用。

圖1. C10（左圖A和C）和SNAC（右圖B和D）對(duì)Caco-2細(xì)胞單層膜的影響^[3]

NCI-N87是從一名男性胃癌患者的胃中分離出的具有上皮形態(tài)的細(xì)胞系^[5]，很少用于腸道滲透性評(píng)價(jià)。但是由于口服司美格魯肽的相關(guān)機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，其吸收部位主要是胃。因此研究者采用NCI-N87細(xì)胞單層進(jìn)行體外滲透研究。結(jié)果顯示在20 mM至80 mM的SNAC濃度范圍內(nèi)，司美格魯肽的Papp值隨著SNAC的濃度增加而增加，見圖2。NCI-N87細(xì)胞攝取試驗(yàn)結(jié)果也顯示，SNAC可提高司美格魯肽的細(xì)胞內(nèi)攝取。

圖2. NCI-N87單層細(xì)胞中不同SNAC濃度對(duì)司美格魯肽體外滲透系數(shù)P_app值的影響^[5]

尤斯灌流（Ussing chamber）模型

Ussing chamber模型可以在體外研究特定腸段的滲透，且為了排除漿膜層和肌肉層對(duì)藥物滲透的影響，可對(duì)腸段進(jìn)行剝膜處理僅保留粘膜層。藥物的吸收過(guò)程發(fā)生在粘膜表面，而漿膜層和肌肉層對(duì)于滲透性本身較差的化合物可能產(chǎn)生不利影響。在多肽的滲透性研究中，經(jīng)常會(huì)用到多種促滲透劑，高濃度的促滲透劑可能影響腸道活性。Ussing chamber模型可通過(guò)檢測(cè)電生理參數(shù)，對(duì)腸道活性進(jìn)行監(jiān)測(cè)。此外，與腸灌流或腸外翻實(shí)驗(yàn)相比，Ussing chamber模型操作簡(jiǎn)單，具有更高的通量。Ussing chamber模型比較適合評(píng)價(jià)口服多肽的體外滲透性。

Stephen等人^[6]采用Ussing chamber模型，研究SNAC對(duì)司美格魯肽在大鼠胃黏膜的滲透性影響。大鼠胃黏膜在SNAC中持續(xù)暴露10分鐘，接著移走SNAC，分別在10分鐘，30分鐘和60分鐘加入司美格魯肽。結(jié)果顯示，司美格魯肽的滲透性在10分鐘加入時(shí)最高，30分鐘和60分鐘加入時(shí)已經(jīng)恢復(fù)到基線水平，見圖3。說(shuō)明SNAC的促滲透作用是短暫的。

圖3. 大鼠胃黏膜中SNAC對(duì)司美格魯肽的滲透性影響^[6]

Sarinj等人^[7]采用Ussing chamber模型，研究SNAC增強(qiáng)奧曲肽在大鼠和人腸上皮粘膜的滲透性，見圖4。研究結(jié)果顯示，添加20 mM SNAC可增加奧曲肽在大鼠不同腸段上皮粘膜的通透性，P_app分別為：結(jié)腸（增加3.2倍）>回腸（3.4倍）>空腸（2.3倍）>十二指腸（1.4倍）>胃（1.4倍）。添加20 mM或40 mM SNAC也能增加奧曲肽在人結(jié)腸粘膜的通透性，Papp分別增加了1.5倍和2.1倍。添加SNAC后，特別是在結(jié)腸區(qū)域，跨膜電阻（TEER）值降低。該結(jié)果顯示出SNAC可作為奧曲肽的腸滲透促進(jìn)劑。

圖4. 奧曲肽在大鼠各腸段（左圖）和人結(jié)腸（右圖）上皮粘膜的滲透性^[7]

Foger等人^[8]采用Caco-2單層細(xì)胞模型和Ussing chamber的腸粘膜模型，評(píng)價(jià)可溶性多肽的體外滲透性，并與體內(nèi)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，Ussing chamber的腸粘膜模型測(cè)得的P_app值與體內(nèi)生物利用度具有非常好的相關(guān)性（R²=0.81），Caco-2模型測(cè)得的Papp值與體內(nèi)生物利用度的相關(guān)性較差（R²=0.48）。

體內(nèi)PK研究

口服多肽的體內(nèi)PK研究方面，需要選擇相關(guān)動(dòng)物種屬進(jìn)行藥代研究，且考慮到體內(nèi)吸收較差，血藥濃度較低，對(duì)于分析檢測(cè)靈敏度也具有更高的要求，有能力的情況建議做到pg/mL級(jí)別。另外還需要關(guān)注是否需要禁食，多肽在腸道的吸收部位，以及促滲透劑的劑量設(shè)計(jì)等問(wèn)題。

• 食物影響：口服司美格魯肽的體內(nèi)藥代研究發(fā)現(xiàn)，食物的存在會(huì)影響口服多肽的吸收，空腹?fàn)顟B(tài)下生物利用度更高。因此口服多肽的PK研究，推薦在空腹條件下進(jìn)行^[6]。

圖5. 健康受試者在餐后和空腹條件下口服司美格魯肽的血藥濃度時(shí)間曲線^[9]

• 吸收部位：在胃腸道中，小腸具有最大的表面積，且小腸膜也比胃的更易穿透，因此大多數(shù)藥物主要在小腸吸收。但是研究發(fā)現(xiàn)胃也可能是口服多肽的主要吸收部位。口服司美格魯肽在幽門結(jié)扎和非結(jié)扎的犬中吸收是相當(dāng)?shù)模以谌㈧o脈中的血藥濃度大大高于肝門靜脈，說(shuō)明口服司美格魯肽的主要吸收部位是胃而不是小腸^[6]。另外，在腸道中通過(guò)淋巴系統(tǒng)吸收來(lái)提高治療性多肽的口服生物利用度的效果是非常有限的。

圖6. 口服司美格魯肽在幽門結(jié)扎和不結(jié)扎的Beagle犬中吸收曲線（左圖）和口服司美格魯肽在犬脾靜脈和肝門靜脈中的吸收曲線（右圖）^[6]

• 促滲透劑：人體內(nèi)給予5 mg的司美格魯肽，分別合用150 mg，300 mg或600 mg的促滲透劑SNAC，結(jié)果顯示合用300 mg SNAC的司美格魯肽血漿暴露量最高。過(guò)高劑量的SNAC可能產(chǎn)生鹽析作用，反而不利于多肽的口服吸收^[6]。此外，同樣的促滲透劑對(duì)不同的多肽可能具有不同的作用。比如在大鼠體內(nèi)，SNAC可以促進(jìn)司美格魯肽的口服吸收，但是卻不能促進(jìn)利拉魯肽的口服吸收。而促滲劑也可促進(jìn)淋巴吸收，在前期文章“大鼠腸系膜淋巴管插管模型驗(yàn)證滲透促進(jìn)劑SNAC對(duì)淋巴吸收的影響"中已有詳細(xì)介紹。

結(jié)語(yǔ)

本文從口服多肽的研究目的著手，介紹了用于評(píng)價(jià)多肽藥物胃腸道吸收的研究方法和數(shù)據(jù)解讀。口服多肽的吸收較差，血藥濃度較低，一般需要非常高的檢測(cè)靈敏度。藥明康德DMPK在口服多肽的藥代動(dòng)力學(xué)研究方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，可開發(fā)具備高選擇性、高靈敏度和寬線性范圍的多肽生物分析方法。在體外Caco-2細(xì)胞模型上，已經(jīng)完成數(shù)百個(gè)多肽化合物的體外滲透性評(píng)價(jià)。Ussing chamber模型是比較推薦的針對(duì)口服多肽的體外研究模型，藥明康德DMPK部門已經(jīng)建立了Ussing chamber模型用于體外滲透性評(píng)價(jià)，尤其在腸道剝膜技術(shù)和腸粘膜的質(zhì)量把控方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。借助多種不同類型的針對(duì)口服多肽胃腸道吸收的評(píng)價(jià)體系，我們希望可以助力口服多肽的早期研發(fā)。

文章來(lái)源：評(píng)價(jià)口服多肽藥物胃腸道吸收的研究方法及應(yīng)用 - 藥明康德DMPK