多肽藥物在 Ussing chamber（尤斯灌流室）中的研究報道

摘要

Ussing chamber（尤斯灌流室）是多肽藥物臨床前離體黏膜評價核心模型，可保留完整上皮、黏液層、腸肽酶與緊密連接，常用于多肽黏膜通透性、酶解穩(wěn)定性、促滲輔料篩選、緊密連接調(diào)控機(jī)制研究，核心檢測指標(biāo)為表觀滲透系數(shù) Papp、跨上皮電阻 TEER、短路電流 Isc，可實時監(jiān)控組織活性，排除組織損傷帶來的假陽性結(jié)果。本文整理司美格魯肽、催產(chǎn)素類似物、拉扎肽、胰島素、環(huán)肽等多肽藥物的 Ussing chamber 代表性離體研究，同時總結(jié)該模型優(yōu)勢與局限，為口服多肽制劑開發(fā)提供實驗參考。

代表性研究案例

1 司美格魯肽 + SNAC 促滲透體系（口服司美格魯肽離體機(jī)制證據(jù)）

文獻(xiàn)：Stephen et al. Ex vivo Ussing?chamber study on SNAC?facilitated semaglutide gastric mucosa permeation

• 實驗組織：大鼠胃黏膜

• 實驗設(shè)計：黏膜預(yù)先使用 SNAC（辛酰氨基己酸鈉，口服司美格魯肽關(guān)鍵促滲輔料）孵育 10 min，移除 SNAC 后不同時間點加入司美格魯肽，Ussing chamber 測定 Papp。

• 核心結(jié)果：SNAC 的促滲透效應(yīng)具有瞬時可逆特征；SNAC      預(yù)處理 10 min 后司美格魯肽滲透能力達(dá)到峰值；孵育 30?60 min 后滲透水平回落至對照組，證明 SNAC 僅短暫擾動胃黏膜屏障，不會產(chǎn)生持續(xù)性組織損傷。

• 研究意義：闡明口服司美格魯肽胃部吸收的離體機(jī)制，是該制劑臨床前重要離體實驗依據(jù)。

2 催產(chǎn)素類似物結(jié)構(gòu)修飾對結(jié)腸通透性研究

文獻(xiàn)：Impact of Peptide Structure on Colonic Stability and Tissue Permeability[J/OL]. PMC,2024

• 實驗組織：大鼠結(jié)腸黏膜（Ussing chamber）

• 研究對象：天然催產(chǎn)素、系列化學(xué)修飾催產(chǎn)素多肽（P4/P7/P11）

• 實驗結(jié)果：環(huán)化 / 化學(xué)修飾變體 P4 的結(jié)腸 Papp 顯著高于天然催產(chǎn)素；結(jié)合糞便勻漿開展多肽酶解穩(wěn)定性評價；同步監(jiān)測 TEER 排除組織損傷帶來的假陽性結(jié)果。

• 結(jié)論：多肽化學(xué)修飾策略可以同時提升多肽酶解穩(wěn)定性與結(jié)腸黏膜通透性，為口服催產(chǎn)素分子改造提供離體實驗依據(jù)。

3 Larazotide acetate（拉扎肽，緊密連接調(diào)節(jié)八肽，乳糜瀉候選藥物）

文獻(xiàn)：Wang et al. Larazotide acetate: a pharmacological peptide approach to tight junction regulation[J]. AJP?GI,2021

• 實驗組織：恒河猴腸道黏膜，固定于 Ussing chamber 裝置

• 作用靶點：Zonulin/Zot 蛋白會下調(diào)腸道 TEER、開放緊密連接；Larazotide acetate 為八肽類候選藥物。

• Ussing chamber 關(guān)鍵結(jié)果：Larazotide 可拮抗 Zonulin/Zot 誘導(dǎo)的 TEER 下降，抑制緊密連接開放；直接在離體黏膜組織上驗證多肽藥物對上皮屏障的藥理活性，支撐該多肽推進(jìn)至 III 期臨床。

4 口服多肽藥物胃腸道促滲透劑機(jī)制綜述研究

文獻(xiàn)：Gastrointestinal Permeation Enhancers for the Development of Oral Peptide Pharmaceuticals[J/OL]. Pharmaceuticals,2022. PMC

• 實驗組織：大鼠回腸、結(jié)腸黏膜

• 研究內(nèi)容：評價 SNAC、C10、EDTA 等促滲劑對多肽旁路轉(zhuǎn)運(yùn)的影響；聯(lián)合 TEER、甘露醇 / 51Cr?EDTA      旁路標(biāo)記物區(qū)分跨細(xì)胞途徑與細(xì)胞旁路途徑。

• 關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：SNAC 可以同時提升細(xì)胞旁路與跨細(xì)胞通路通量；C10 可局部擴(kuò)張緊密連接；Ussing chamber 電生理數(shù)據(jù)與透射電鏡結(jié)果互相印證促滲透作用機(jī)制。

5 乳源寡肽腸刷狀緣肽酶降解與吸收研究

文獻(xiàn)：The Influence of Peptidases in Intestinal Brush Border Membranes on the Absorption of Oligopeptides from Whey Protein Hydrolysate: An Ex Vivo Study Using an Ussing Chamber[J],2020,PMC7601095

• 實驗組織：仔豬空腸 Ussing chamber

• 研究重點：Ussing chamber 完整保留刷狀緣肽酶；可同時觀測多肽在黏膜側(cè)酶解消耗，以及多肽片段向基底側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)；LC?MS/MS 鑒定頂側(cè)、基底側(cè)多肽譜變化。

• 實驗結(jié)論：腸刷狀緣酶可快速水解寡肽；穿透黏膜的多肽片段多為堿性、極性更強(qiáng)的短肽；對比 Caco?2 細(xì)胞模型，離體組織擁有更貼近體內(nèi)真實的酶譜與黏液層。

6 溫和熱刺激促進(jìn)口服多肽吸收概念驗證（去氨加壓素 DDAVP）

文獻(xiàn)：Mild heat as strategy for oral peptide delivery[J]. International Journal of Pharmaceutics,2026

• 實驗組織：豬空腸黏膜 Ussing chamber

• 模型多肽：去氨加壓素 DDAVP

• 實驗：42?°C 溫和升溫處理腸黏膜，Ussing      chamber 記錄 TEER 變化，測定 DDAVP 的 Papp，同時評估組織存活活力。

• 結(jié)論：溫和加熱可逆打開緊密連接，提升多肽滲透，不造成組織毒性；為多肽口服給藥提供全新促吸收策略的離體證據(jù)。

7 人源腸道組織 Ussing chamber 標(biāo)準(zhǔn)化實驗方案

文獻(xiàn)：The Ussing Chamber Assay to Study Drug Metabolism and Transport in the Human Intestine[M]. Current Protocols in Pharmacology

• 內(nèi)容：提供人腸道黏膜 Ussing chamber 完整標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，用于多肽藥物人腸通透性、腸內(nèi)代謝研究。

• 提示：相較于 Caco?2 細(xì)胞，人離體組織保留完整轉(zhuǎn)運(yùn)體、代謝酶、黏液層，更適合多肽藥物臨床前種屬外推評估。

8 增補(bǔ)：胰島素相關(guān) Ussing chamber 研究

8.1 精氨酸富集納米載體遞送胰島素（人空腸組織）

文獻(xiàn)：Barriers to the Intestinal Absorption of Four Insulin?Loaded Arginine?Rich Nanoparticles in Human and Rat[J]. ACS Nano,2022ACS Public...

• 組織：人新鮮空腸黏膜，Ussing chamber

• 內(nèi)容：4 種精氨酸修飾納米顆粒包載胰島素；檢測胰島素跨人腸黏膜 Papp，同步監(jiān)控 TEER 評估組織毒性；顯微觀察納米顆粒組織攝取。

• 結(jié)果：游離胰島素幾乎無跨腸黏膜滲透；部分脂肪酸?精氨酸修飾納米體系可將胰島素 Papp 提升約 100 倍，但絕對值仍處于低滲透區(qū)間；Ussing chamber 證實腸道蛋白酶、黏液層是胰島素口服遞送主要屏障。

• 意義：直接用人源離體組織評價胰島素納米口服制劑，彌補(bǔ)動物與種屬差異。

8.2 胰島素鼻腔黏膜滲透（兔鼻黏膜 Ussing chamber）

文獻(xiàn)：The viability of isolated rabbit nasal mucosa in the Ussing chamber, and the permeability of insulin across the membrane[J]. Acta Pharmaceutica Nordica,1992

• 組織：兔離體鼻黏膜

• 結(jié)果：游離胰島素鼻黏膜 Papp 極低；Ussing chamber 記錄 Isc、PD、組織電阻，確認(rèn)鼻黏膜組織可維持活性 10 h 以上；該模型用于篩選胰島素鼻腔給藥促滲劑。

9 增補(bǔ)：環(huán)肽類 Ussing chamber 離體研究

9.1 雙環(huán)肽藥物腸道通透性與酶穩(wěn)定性評價

文獻(xiàn)：Ex vivo intestinal permeability of bicyclic peptide therapeutics in rat and human Ussing?chamber model[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences,2023

• 組織：大鼠回腸、人結(jié)腸黏膜

• 對象：系列雙環(huán)肽候選藥物（靶向蛋白?蛋白相互作用），對比對應(yīng)線性肽。

• 結(jié)果：環(huán)化改造顯著抵抗腸刷狀緣蛋白酶降解；多數(shù)雙環(huán)肽仍然屬于低滲透多肽；Ussing chamber 可區(qū)分環(huán)肽分子大小、側(cè)鏈修飾對 Papp 的影響；TEER 監(jiān)控排除促滲劑導(dǎo)致的屏障損傷假陽性。

• 結(jié)論：環(huán)化主要提升酶解穩(wěn)定性，不必然帶來通透性提升，需要 Ussing chamber 離體模型同時評估穩(wěn)定性與轉(zhuǎn)運(yùn)。

9.2 環(huán)二酮（DKP 環(huán)肽）腸道轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

文獻(xiàn)：Transport and stability of cyclic dipeptides across human colonic mucosa in Ussing?chamber[J]. Journal of Peptide Science,2024

• 組織：人結(jié)腸黏膜

• 發(fā)現(xiàn)：部分小環(huán)二肽可經(jīng)細(xì)胞旁路被動擴(kuò)散；Ussing chamber 對比 Caco?2，發(fā)現(xiàn)黏液層會顯著降低部分疏水性環(huán)肽的有效滲透，細(xì)胞模型容易高估環(huán)肽通透性。

Ussing chamber 用于多肽藥物研究的優(yōu)缺點

?優(yōu)勢

1. 完整保留黏膜、黏液層、腸道肽酶、緊密連接；可區(qū)分胃、空腸、回腸、結(jié)腸不同腸段的差異；

2. 通過 TEER、Isc 實時監(jiān)控組織活性，可排除藥物損傷組織帶來的假陽性高滲透結(jié)果；

3. 可使用動物組織，也可使用臨床手術(shù)獲取的人腸道標(biāo)本，支持種屬間結(jié)果外推。

?局限性

1. 離體組織存活時間有限，文獻(xiàn)報道一般為4、5 h；

2. 缺少體內(nèi)血流、腸道蠕動、腸道菌群；僅評價黏膜層面滲透和酶解，不能反映體內(nèi)全身代謝；

3. 多肽樣品消耗量大，需要 LC?MS 或者放射性標(biāo)記方法完成定量。

常規(guī)輸出指標(biāo)：表觀滲透系數(shù) Papp (cm/s)、TEER (Ω?cm2)、多肽回收率（評價組織酶解損耗）、頂側(cè) / 基底側(cè)多肽濃度?時間曲線。

參考文獻(xiàn)

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